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　　一 、細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測

　　1.試劑平衡至室溫。準(zhǔn)備：消毒臺(tái)面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉簽，草紙和有蓋垃圾桶（內(nèi)裝有消毒劑）。

　　2.寫編號(hào)紙并編號(hào)。1－－－－IgG1/ IgG1/ IgG12－－－－CD4/CD8/CD33－－－－CD14/CD454－－－－

　　3.每管加相應(yīng)的抗體10l/每種和50l全血，震蕩，室溫避光20分鐘。加血搖勻血樣。

　　4.加入溶血素1ml，震蕩后室溫避光10分鐘。

　　5.離心，1200轉(zhuǎn)， 5分鐘。棄上清，震蕩。

　　6.加入PBS洗液2ml，震蕩，離心，1200轉(zhuǎn)， 5分鐘。棄上清，震蕩。

　　7.加入PBS 900l。上機(jī)4度保存。

　　8.上機(jī)。

　　二 、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測

　　1.準(zhǔn)備：消毒臺(tái)面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉簽，草紙和有蓋垃圾桶（內(nèi)裝有消毒劑）。

　　2.寫編號(hào)紙并編號(hào)。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3

　　3.（3－5在超凈臺(tái)操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和離子霉素（1∶10），使用無菌無疊氮鈉PBS稀釋儲(chǔ)存液。

　　4.刺激：取全血或PBMCs（細(xì)胞數(shù)在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640進(jìn)行稀釋一倍，加入刺激劑PMA，離子霉素和BFA，混勻。后在全血中的終濃度：PMA:50ng/ml離子霉素：1g/mlBFA：10g/ml。

　　5.37℃，5% CO2 ，4小時(shí)孵育(好用培養(yǎng)箱，松蓋) 。

　　6.胞外染色：各管中加入相應(yīng)的表面抗體20l和激活的全血100l混勻，室溫避光20分鐘。

　　7.溶血：每管加入溶血素2ml，室溫避光10分鐘。離心，1200轉(zhuǎn)， 5分鐘。棄上清。

　　8.破膜通透：每管加入0.5ml通透劑，室溫避光10分鐘。加入2mlPBS，1000轉(zhuǎn)，離心5分鐘。棄上清。

　　9.胞內(nèi)染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗體20l，混勻，室溫避光30分鐘。加入2ml PBS，1000轉(zhuǎn)，離心5分鐘，棄上清。

　　10.加入PBS 500l。上機(jī)4度保存。

　　11.上機(jī)檢測。