要想底氣十足地秀出你的WB實驗結(jié)果，單單內(nèi)參對照就是一門學(xué)問。在對靶
蛋白進(jìn)行分析時，先考慮是否等量上樣，其次考慮信號是否屬于檢測的線性范圍。那么，內(nèi)參蛋白就尤為重要！
通常，感覺內(nèi)參蛋白就是 β-actin 或 GAPDH 等。實際上，可以選擇的內(nèi)參有很多，而選擇內(nèi)參有一定的標(biāo)準(zhǔn)。，實驗條件不能改變內(nèi)參蛋白上樣量。第二，對照內(nèi)參的分子量必須與靶蛋白不同。第三，也是重要的一點，檢測到的內(nèi)參蛋白和靶蛋白的信號必須在一個線性范圍內(nèi)，否則你會發(fā)現(xiàn)你的條帶無法進(jìn)行定量。
然而，實際操作中，很多同學(xué)沒有意識到上述的第三個標(biāo)準(zhǔn)。他們認(rèn)為，印跡上的內(nèi)參蛋白數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量成正比，但這可能是錯誤性的假設(shè)而已，特別是使用單個內(nèi)參蛋白對多種 WB 實驗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時。實際上，沒有一種內(nèi)參蛋白能同時滿足以上3 點標(biāo)準(zhǔn)，又適用于你各種不同靶點的實驗。通常內(nèi)參蛋白遠(yuǎn)比靶蛋白豐富得多。在同一稀釋度下，測定內(nèi)參和靶蛋白時，內(nèi)參蛋白的信號可能較為飽和，甚至?xí)^檢測線性動態(tài)范圍，這就導(dǎo)致不能報告出泳道之間的差異。
當(dāng)然 WB 的信號也與檢測方法緊密相關(guān)。與膠片相比，使用電荷耦合器件 (CCD) 相機(jī)檢測增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光 (ECL) 可產(chǎn)生出色的線性動態(tài)范圍。如果數(shù)字信號飽和，則可以使用軟件設(shè)置來顯示紅色像素。經(jīng)證實，熒光掃描（使用與熒光染料而不是過氧化物酶偶聯(lián)的二抗）可避免發(fā)光化學(xué)的固有限制，因而更好。所以在設(shè)置實驗時，采用這些方法可能意味著更少的梯度稀釋次數(shù)。但如果你的實驗室無法使用新好的技術(shù)，你也可以使用傳統(tǒng)ECL 和膠片獲得較好的數(shù)據(jù)，但需要你花時間設(shè)置實驗，解決等量上樣和動態(tài)范圍問題。
既往還有文獻(xiàn)推薦在做實驗，好考慮使用 5 個內(nèi)參蛋白，這有助于你發(fā)現(xiàn)至少一個（好的時候多個）在靶蛋白線性范圍內(nèi)的內(nèi)參，但使用多個內(nèi)參蛋白存在耗費(fèi)時間、試劑的問題，特別是樣品珍貴的情況下。所以相對可行的是測定每個樣品泳道中的總蛋白上樣量，無需探測多個內(nèi)參蛋白。對每個泳道的所有蛋白條帶或多個離散條帶進(jìn)行染色和掃描，同時還要確保染色劑不會干擾后續(xù)的免疫檢測。
對于許多研究生和博士后，可能會覺得進(jìn)行 WB 實驗是“常規(guī)程序”。但也不要忘了，解釋實驗的數(shù)據(jù)時，細(xì)節(jié)決定成敗。仔細(xì)考慮樣品制備、轉(zhuǎn)移條件和一抗等問題，將幫助你避免出現(xiàn)失誤。到了文章發(fā)表的時候，記得提供所有詳細(xì)信息，以便其他人準(zhǔn)確評估結(jié)果并重復(fù)做出實驗。這才是負(fù)責(zé)地進(jìn)行 WB 實驗嘛！
客服一
