PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間，般為48h以內(nèi)，有些好于當(dāng)日進(jìn)行檢查，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
但有時(shí)仍會(huì)與到這樣那樣的問(wèn)題，影響檢測(cè)結(jié)果的判斷，具體歸類為以下常見(jiàn)的4點(diǎn)，描述如下：
問(wèn)題：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物
現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)。
原因：
1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer對(duì)樣品不合適。
3、引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解。
4、反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。
對(duì)策：
1、純化模板或者使用
試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更換Buffer或調(diào)整濃度。
3、重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二結(jié)構(gòu)）或者換管新引物。
4、降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。
問(wèn)題二：非特異性擴(kuò)增
現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不致或者非特異性擴(kuò)增帶。
原因：
1、引物特異性差。
2、模板或引物濃度過(guò)高。
3、酶量過(guò)多。
4、Mg2+濃度偏高。
5、退火溫度偏低。
6、循環(huán)次數(shù)過(guò)多。
對(duì)策：
1、重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR。
2、適當(dāng)降低模板或引物濃度。
3、適當(dāng)減少酶量。
4、降低鎂離子濃度。
5、適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問(wèn)題三：拖尾
現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因：
1、模板不純。
2、Buffer不合適。
3、退火溫度偏低。
4、酶量過(guò)多。
5、dNTP、Mg 2+濃度偏高。
6、循環(huán)次數(shù)過(guò)多。
對(duì)策：
1、純化模板。
2、更換Buffer。
3、適當(dāng)提高退火溫度。
4、適量用酶。
5、適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問(wèn)題四：假陽(yáng)性
現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。
原因：
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。
對(duì)策：
1、操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
2、除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)次性使用。
3、各種試劑好行分裝，然后低溫貯存。
客服一
