技術(shù)文獻(xiàn)
蛋白質(zhì)樣品的制備，是蛋白質(zhì)研究的步，不論后續(xù)采用何種分離或鑒定手段，樣品制備都是重要步驟。
蛋白質(zhì)樣品制備的意義
生物的蛋白質(zhì)種類多達(dá) 10 萬種以上，樣品中的蛋白質(zhì)種類也可達(dá)到1萬種以上，但大部分蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)很少，因此通過樣品制備起到濃縮蛋白質(zhì)的作用。
去除樣品中各種非蛋白質(zhì)的影響。
如何進(jìn)行蛋白質(zhì)的制備
蛋白樣品制備包括蛋白質(zhì)的分離，提取和純化。從各類研究角度而言，樣品制備都要盡可能獲得所有樣品中的蛋白質(zhì)，但是由于蛋白質(zhì)種類多，豐度不一，物化特性多樣等因素，要到達(dá)真正的完全蛋白質(zhì)制備是非常困難的。
在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面試驗(yàn)中彌補(bǔ)回來的！
樣品制備的原則:
盡可能采用簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行樣品的制備。
盡可能提高樣品的溶解度，使所有待分析的蛋白質(zhì)樣品全部處于溶解狀態(tài)，且穩(wěn)定可重復(fù)。
盡可能減少蛋白的降解。
根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)選擇決定提取蛋白的方法，例如提取變性還是活性蛋白，提取總蛋白還是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分蛋白。
盡量去除干擾下游應(yīng)用的雜質(zhì)，包括但不僅限于核酸，組織碎片，或某些高豐度無關(guān)蛋白。
樣品制備的基本流程：
樣品的破碎
樣品的裂解
雜質(zhì)的去除及蛋白質(zhì)溶液的獲取
樣品的破碎
為了完全分析細(xì)胞內(nèi)蛋白，樣品必須經(jīng)過有效的破碎，破碎方法的選擇依賴于樣品來源不同（如組織，固定組織，難研磨組織，脂肪，菌體）而不同，同時(shí)也依賴于提取蛋白的類型（如是獲取總蛋白還是特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分）。
通常組織樣品和微生物樣品都需要進(jìn)行破碎處理，而細(xì)胞樣品不需要。破碎可以通過滲透，凍融，酶解，超聲，高壓，液氮研磨，機(jī)械勻漿，玻璃珠勻漿等方式完成。選擇破碎方式時(shí)也要考慮使用的裂解液配方是否可以完美的配合，以得到佳的提取效果。提取總蛋白時(shí)需要盡量的破碎樣品釋放蛋白，而特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離則需要根據(jù)提取方法采用合適的破碎方式。
提示：內(nèi)源性的蛋白酶通常存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞破碎時(shí)可能會(huì)釋放出來，導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的降解，從而影響下游實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此可在細(xì)胞裂解添加蛋白酶抑制劑加以保護(hù)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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