（1） 質(zhì)粒的提取 (Tiangen質(zhì)粒提取試劑盒)：
a） 挑菌： 選取培養(yǎng)板中大小中等的單個菌落， 消毒牙簽接種到10ml搖菌管中， 其中含有卡那霉素的LB約5ml， 37 °C， 220rpm恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過夜。
b） 取上述2.0ml培養(yǎng)液， 于常溫下12000 rpm離心1分鐘， 棄上清， 干燥沉淀。
c） 加入250ul溶液P1(配有去RNA酶， 4 °C保存)， 渦旋振蕩， 完-全懸浮細(xì)菌，不能留有沉淀， 否則會影響裂解。
d） 加入250ul溶液P2， 快速上下顛倒8次， 常溫靜置3分鐘， 可見混合液逐漸變清、 粘稠， 表示已充分裂解。
e） 再加入350 ul溶液Ⅲ， 快速上下顛倒8次， 可見白色絮狀物出現(xiàn)。
f） 常溫12000rpm離心10分鐘， 所得上清液倒入已經(jīng)用BL平衡過的過濾柱中，注意不要倒入白色絮狀物沉淀， 靜置3分鐘， 12000 rpm離心1分鐘。
g） 加入500 ?l溶液PD， 12000 rpm離心1分鐘。
h） 加入600 ?l溶液PW， 12000 rpm離心1分鐘； 此步驟再重復(fù)1次； 棄廢液后空管再次12000 rpm離心2分鐘。
i） 于超凈臺通風(fēng)干燥， 放置2-5分鐘， 加入33ul已加熱至65 °C的已滅菌的ddH 2 O， 室溫靜置3分鐘， 12000 rpm離心2分鐘， 得到相關(guān)質(zhì)粒DNA， 測濃度， -20 °C保存?zhèn)溆谩?br />
（2） 質(zhì)粒鑒定及保存
取100ng上述提取的質(zhì)粒， 進行酶切（反應(yīng)體系見）， 隨后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定（方法同所述）， -后將粗略鑒定正確的樣本送至生物技術(shù)公司測序。 如測序正確， 用50%滅菌甘油300?l+700?l的菌液， 標(biāo)記于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br />11） 質(zhì)�；騊CR產(chǎn)物純化（膠回收）
（1） 瓊脂糖電泳酶切或 PCR 相關(guān)產(chǎn)物。
（2） 在紫外投射反射儀割取含有目的片段的瓊脂糖凝膠片段， 割取要迅速， 以避免紫外線對 DNA 的損傷， 但注意盡量割取目的片段， 減少無目的片段的凝膠量， 以便提高純化回收效率。
（3） 用天平稱先稱區(qū)空 EP 管重量， 再稱取含有凝膠的 EP 管重量， 計算得到凝膠重量（mg）， 加入等量體積（?l） Bindingbuffer（如 1 mg=1 μl）。
（4） 將含有凝膠的 EP 管置入 60 °C 恒溫水浴箱中融化凝膠， 持續(xù) 8-10min，間或拿出搖勻， 以確保完-全凝膠溶解。
（5） 將上述凝膠溶液轉(zhuǎn)移至干凈的純化柱上， 室溫下靜置吸附 3 分鐘。
（6） 將純化柱 12000rpm 離心 1 分鐘， 棄超濾液， 必要時可將超濾液重新離心1 次可提供純化效率； 再次加入 100?l Binding buffer， 12000rpm 離心 1 分鐘。
（7）加入 700?l Wash buffer （事先已經(jīng)加入無水乙醇）， 12000 rpm 離心 1 分鐘，棄超濾液； 空管 12000 rpm 離心 2 分鐘。
（8） 純化柱置于 1.5 毫升干凈離心管中， 于超凈臺通風(fēng)干燥 5 分鐘。
（9） 加入 30?l 已加熱至 65 °C 的已滅菌的 ddH 2 O， 室溫靜置 3 分鐘， 12000 rpm離心 2 分鐘， 得到相應(yīng)的 DNA 片段， 測濃度， -20 °C 保存?zhèn)溆谩?br type="_moz" />
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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