技術(shù)文獻(xiàn)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，并對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。其涉及域包括：臨床疾病診斷、動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫、食品安全和科學(xué)研究等。在xin型guan狀病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革熱、感染性腹瀉等的檢測(cè)、診斷和治療上發(fā)揮著重要作用。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可分別為SYBR Green l熒光染料法和Taqman探針法。日常進(jìn)行核酸檢測(cè)就是運(yùn)用Taqman探針法，新guan病毒核酸檢測(cè)也是利用此項(xiàng)技術(shù)。該法高度特異，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。
在Taqman探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q），如TAMRA等。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，儀器不能檢測(cè)信號(hào)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’→5’外切核酸酶活性被探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，能量不能被吸收，就產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)就和目的片段一樣有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)過程。
這里涉及基線和CT值的概念�；�是用來確定背景的熒光信號(hào)強(qiáng)度的參比對(duì)照，相當(dāng)于PCR指數(shù)擴(kuò)增期以的熒光強(qiáng)度水平。CT值是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，其由擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定。
與傳統(tǒng)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR有著以下優(yōu)點(diǎn)：
1．檢測(cè)結(jié)果既可以定性，也可以定量；
2．檢測(cè)靈敏度高；
3．無(wú)需進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了效率。
圖1 Taqman探針法工作原理
圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾個(gè)主要參數(shù)
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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