總是會看到人家提取的
細胞，拍的漂漂亮亮的圖片，在面前晃，然而，輪到自己，發(fā)現(xiàn)并不是準備細胞—固定細胞—細胞通透—封閉—上一抗—上二抗-染核-鏡檢這么簡單，后來發(fā)現(xiàn)，不要50個字都可以形容出來的實驗步鄹，卻這么難。。。
五點建議讓你避開免疫熒光的坑，美美的show一把自己的成果，也對的起因為實驗掉的大把的頭發(fā)了。
1.考慮
抗體的建議稀釋度，以實現(xiàn)高的信背比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會導致較高的背景染色。”
2.利用生理
溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信背比。
3.熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。
4.在設(shè)計多重實驗時，應考慮每種熒光基團的獨特性質(zhì)，如吸收波長和發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素一定要讓您的試劑和使用的
儀器匹配；
5.一定要有對照，原代細胞免疫熒光實驗中，一般建議使用不表達目標的細胞或組織作為陰性對照。而熒光Western blot或ELISA技術(shù)中，含有目標抗原的
蛋白或肽段適合作為陽性對照。
一些常見的坑：
一．信號弱或無信號，染色細胞過少可以考慮以下幾點：
1.目標蛋白在細胞中沒有表達
解決辦法：制備細胞裂解液，用 Western Blo tting 驗證目標蛋白在細胞中是否表達
2.表達目標蛋白的細胞過少
解決辦法：標本中使用更多的細胞，試用其他瞬 時轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系
3.細胞通透性差
增加通透劑作用的時間或者濃度，或 改用其它的通透劑
4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位
改用其他固定方法
5.抗體問題
抗體不適合，抗體選擇錯誤或者抗體稀釋不標準也會導致無信號，建議按標準稀釋，同一樣品按*佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定*佳的一抗稀釋比例，
二.視野中細胞不細胞之間存在散在的發(fā)光點：
答：：1，拍照時 PBS 量過少引起的非特異性；
PBS 未過濾，未溶解的殘渣黏附而導致
三．鏡下觀察只有 DAPI 的藍光，目的熒光幾乎沒有或者很弱？
出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發(fā)熒光強度丌夠大；二抗孵育時是否是對應的種屬。
四．細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點？
此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2周后再檢測，或者通過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體熒光。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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