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Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

 

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。

 

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
 

試劑準(zhǔn)備：
 
1.  SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。
 
2.  勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
 
3.  轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
 
4.  0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
 
5.  膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
 
6.  顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

免疫反應(yīng)：

1.  一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定*佳條件。

2.  顯色液必須新鮮配置使用，*后加入H2O2。

3.  DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。
 

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司